實時熒光定量PCR檢測服務所使用的熒光化學材料可分為兩大類,即熒光染料和熒光探針。熒光染料以SYBR GreenⅠ為主要代表,是非特異性熒光化學材料。熒光探針包括TaqMan、分子信標、熒光標記引物、雜交探針等,屬于特異性熒光材料。

　　SYBR GreenⅠ是一種能夠與雙鏈DNA小溝結合的染料。在游離狀態下,SYBR GreenⅠ發出微弱的熒光,但是一旦與雙鏈DNA結合,其熒光強度大大增強。因此,一個反應發出的全部熒光信號與出現的雙鏈DNA量成正比,可以根據熒光信號檢測出PCR體系中的雙鏈DNA的數量。其優點是檢測方法簡單,通用性好,價格相對較低,是許多實驗室開展熒光定量實驗。SYBR GreenⅠ的缺點在于它能夠和所有的雙鏈DNA相結合,因此由引物二聚體、單鏈二級結構、非特異性擴增產物引起的熒光信號會影響定量的準確性。但可以通過優化PCR的反應條件、選擇設計良好的引物,來減少或去除引物二聚體和非特異性產物的產生;另外,也可以通過對擴增產物的溶解曲線進行分析來判斷熒光信號的真實性。

　　TaqMan探針技術是有美國Perkin Elmer(PE)公司研制的一種實時PCR定量技術,在PCR擴增加入一對引物的同時加入1個特異性的熒光探針,此熒光探針為一個30~45 bp的寡核苷酸,它設計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對,其5′端標記熒光發射基團,3′端標記熒光淬滅基團。當探針保持完整時,3′端淬滅基團抑制了5′端發射基團的熒光發射。但在PCR擴增中,模板變性后低溫退火,引物與探針同時與模板結合,在引物的介導下,沿模板向前延伸至探針結合處,發生鏈的置換,Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性將探針5′端連接的熒光發射基團從探針上切割下來,游離于反應體系中,從而脫離3'端熒光淬滅基團的屏蔽,接受光刺激發出熒光信號。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是相對應關系,且熒光強度同被釋放的熒光基團的數目也是正比關系,因此該技術可對模板進行準確定量。TaqMan探針技術特異性好、準確性高、假陽性低、重復性比較好。但是需要設計特異性的探針,因此成本較高。

　　分子信標技術是一種呈發夾結構的莖環狀雙標記寡核苷酸探針,環部與靶DNA序列互補,為15~35 bp;莖部是由互相配對的堿基組成,但與靶DNA無序列同源性,約8 bp。在探針的5′端和3′端分別標記熒光發射基團和熒光淬滅基團。當溶液中的模板與分子信標結合配對時,分子信標的構象改變成鏈狀使得熒光發射基團與淬滅基團分開,當熒光基團被激發時,就發出熒光信號。與探針互補的靶分子數量越多,熒光信號也就越強,從而實現了對目的基因的定量檢測。分子信標的方法優點是特異性強,熒光背景低。其缺點是設計困難,雜交探針不能*與模板結合,穩定性較差,價格高。