一、免疫組化技術(shù)的基本原理

應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學技術(shù)或免疫細胞化學技術(shù)。

*，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學物質(zhì)提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體(*抗體)作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶(常用辣根過氧化物酶)或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來(常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒)。通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應產(chǎn)物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。

二、免疫組織化學染色方法

1、按標記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標法和免疫金銀法等。

2、按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法);與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。

3、按結(jié)合方式可分為抗原—抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶(PAP)法和親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)法等，其中SP法是zui常用的方法。

三、幾種常用免疫組織化學方法的原理

1、免疫熒光方法

是zui早建立的免疫組織化學技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在研究病理診斷、檢驗中應用比較廣。

2、免疫酶標方法

免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術(shù)。基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內(nèi)的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標技術(shù)是目前zui常用的技術(shù)。

本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。

免疫酶標方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標記方法，且隨著方法的不斷改進和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的當屬PAP法、ABC法、SP法等。

3、免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內(nèi)的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。

四、免疫組化技術(shù)的優(yōu)點

1、特異性強 免疫學的基本原理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白(keratin)顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時才會出現(xiàn)交叉反應。

2、敏感性高 在應用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍;現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應，使免疫組化方法越來越方便地應用于常規(guī)病理診斷工作。

3、定位準確、形態(tài)與功能相結(jié)合 該技術(shù)通過抗原抗體反應及呈色反應，可在組織和細胞中進行抗原的準確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，這樣就可以進行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對病理學研究的深入是十分有意義的。

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