次氮基三乙酸-瓊脂糖

1 、產(chǎn)品介紹

 Co-NTANUPharoseFF是含次氮基三乙酸（NTA）基團(tuán)的金屬螯合填料，主要用于帶組-氨酸標(biāo)簽（His-tag）蛋白的親和層析。

與亞氨基二乙酸（IDA）配基相比，NTA配基的性能更加均衡，對(duì)螯合劑、還原劑、堿等試劑的耐受性更好，純化過(guò)程洗脫液中脫落的金屬離子少。

2 、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測(cè)試條件為：10%流穿，大腸桿菌表達(dá) 帶組-氨酸標(biāo)簽的重組蛋白，6 min 停留時(shí)間；c 10 cm 柱高下的最 大測(cè)試流速。d 剝離金屬離子后 CIP 過(guò)程的 pH 穩(wěn)定性。

3 、金屬螯合親和層析——NTA

金屬離子親和層析是基于蛋白質(zhì)分子表面的組-氨酸的咪唑基、半胱-氨酸的巰基和色-氨酸吲哚基能與Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+和Ca2+形成穩(wěn)定的配位結(jié)合而進(jìn)行生物大分子分離純化的過(guò)程。不同金屬離子對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力與特異性不同，通常情況下，Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+的親和力依次降低（影響產(chǎn)率），特異性依次升高（影響純度），可根據(jù)分離需求選定合適的金屬離子。以下簡(jiǎn)要闡述Co-NTANUPharoseFF的親和原理（圖 1）。

NUPharose基球修飾上NTA配基后，該配體擁有四個(gè)配位基團(tuán)，其中一個(gè)氮原子和三個(gè)氧原子可以與Co2+形成牢固的螯合物。Co2+可形成6配位數(shù)的八面體結(jié)構(gòu)，剩余的兩個(gè)自由配位點(diǎn)可以與溶劑分子或蛋白質(zhì)分子結(jié)合。Co2+與組-氨酸標(biāo)簽蛋白的兩個(gè)組-氨酸殘基的咪唑基團(tuán)配位結(jié)合的過(guò)程即為金屬螯合填料與目標(biāo)蛋白的特異性結(jié)合過(guò)程。提高緩沖液中咪唑的濃度可以將目標(biāo)蛋白洗脫，洗脫過(guò)程中咪唑和目標(biāo)蛋白競(jìng)爭(zhēng)與Co2+的結(jié)合。降低pH會(huì)影響金屬離子與配體的結(jié)合，因此改變pH也是金屬螯合層析洗脫過(guò)程的方式之一，但pH不宜低于4，pH過(guò)低會(huì)將剝離金屬離子。

金屬離子親和層析過(guò)程的非特異性吸附可能會(huì)來(lái)自離子相互作用、金屬離子與含組-氨酸、半胱-氨酸、色-氨酸蛋白之間的相互作用。前者通過(guò)提高緩沖液的離子強(qiáng)度得到抑制，通常添加500mM的NaCl；后者可在上樣緩沖液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在沖洗過(guò)程中添加咪唑而除去。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可以得到樣品純度和收率均較高的結(jié)果。

Co-NTANUPharoseFF填料在使用過(guò)程中Co2+掉落量少，可連續(xù)使用多次。當(dāng)填料性能明顯下降后可以用EDTA將原金屬離子剝離，重新螯合鎳后再生使用。

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí)，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。Co-NTANUPharoseFF的壓縮比為1.15。為使達(dá)到壓縮比，可通過(guò)柱頭下壓的方法，也可以通過(guò)高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體積分?jǐn)?shù)為67%），使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器），為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵，打開(kāi)柱頭上的閥門/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用 理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱因子（As）來(lái)評(píng)價(jià)。

4.3  螯合金屬離子

Co-NTANUPharoseFF 以預(yù)螯合金屬離子的形式出售，在必要時(shí)可將金屬離子剝離（參照4.7小節(jié)），重新螯合Co2+過(guò)程參照以下步驟。

（1）配制50 mM的CoCl2溶液。

（2）用純水清洗色譜柱，純水用量3~5CV（柱體積），流速100~300 cm/h。

（3）用3~5CV的金屬離子溶液通過(guò)色譜柱，流速50~100cm/h ，螯合完-全后色譜柱底部的顏色從白色變?yōu)?/span>Co2+的粉紅色。

（4）用純水清洗色譜柱除去過(guò)量的金屬離子，純水用量至少5CV，流速100~300cm/h。

（5）用0.3M的NaCl溶液將螯合不穩(wěn)定的金屬離子除去，緩沖液用量至少3 CV，流速100~300 cm/h。

（6）可直接用結(jié)合緩沖液平衡色譜柱。

在裝柱前螯合金屬離子的過(guò)程與上述在色譜柱中螯合一致，可在旋勻儀、反應(yīng)瓶（釜）中螯合金屬離子，1 CV的CoCl2溶液即可，利用過(guò)濾器清洗螯合前后的填料。

4.4  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

金屬螯合填料與磷酸鹽、Tris-HCl等緩沖體系兼容，其中20mM PB+150~500 mM NaCl（pH=7.4）的體系最為常用。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液A。緩沖液A通常不含咪唑（對(duì)于Ni-NTA NUPharose FF，可在樣品中添加5~40mM咪唑，這是兩種填料的區(qū)別），pH在7~8之間居多，呈弱堿性。

在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，該過(guò)程通常需要5~10個(gè)柱體積的緩沖液A，以電導(dǎo)、pH等檢測(cè)信號(hào)參數(shù)不變且與緩沖液A對(duì)應(yīng)為準(zhǔn)。

上樣量可按“mg目標(biāo)蛋白/mL填料"來(lái)設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%，例如Co-NTANUPharoseFF產(chǎn)品對(duì)重組金黃色-葡萄球菌蛋白A（r-SPA，NRPA04）的DBC10%為~40mg/mL，純化r-SPA 時(shí)的上樣量可為20~32mg/mL。除了DBC10%，也可以測(cè)試上樣流穿液中的目標(biāo)蛋白確定上樣量。

上樣后需要3~10 個(gè)柱體積的緩沖液A再平衡層析柱。

4.5  洗雜（Wash）

在緩沖液A中添加5mM的咪唑沖洗層析柱，可以將非特異性結(jié)合的雜蛋白除去。咪唑濃度越高，雜蛋白被除去得越徹-底，但會(huì)降低目標(biāo)蛋白的收率。洗雜過(guò)程咪唑的濃度與不同蛋白的特性相關(guān)，對(duì)于Co-NTANUPharose FF，通常5 mM的濃度可以將雜蛋白除去。洗雜的體積通常為3~10個(gè)柱體積。

4.6  洗脫（Elution）

最-常用的洗脫方式為提高洗脫液中咪唑的濃度（在緩沖液A中加入咪唑），推薦在0~200 mM范圍內(nèi)進(jìn)行階躍洗脫或者線性梯度洗脫。對(duì)于大多數(shù)帶組-氨酸標(biāo)簽的蛋白，200mM的咪唑濃度可以將目標(biāo)蛋白洗脫完-全。對(duì)于一些場(chǎng)合，也可以改變pH，需注意pH不能低于4。

4.7  再生（Regeneration）

在多次使用后，通常是2~7次，需要對(duì)填料進(jìn)行再生，純化同一種蛋白可更多次，試具體情況而定。可以選擇0.5~1柱體積200mM EDTA+500 mM NaCl （pH=7）的緩沖液將金屬離子剝離。金屬離子的重新螯合參照4.3小節(jié)。

4.8  在位清洗（CIP）

通常上述的再生過(guò)程可將填料徹-底清洗。若發(fā)生柱壓升高，或?yàn)榱吮苊饨徊嫖廴荆瑢⒔饘匐x子剝離后可進(jìn)行在位清洗過(guò)程。可采用以下溶劑進(jìn)行在位清洗：2mol/L NaCl ，1mol/L NaOH、70%乙醇或 30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì)，反向效果更佳。清洗后需用3~5 柱體積的純水除去上述溶劑。

4.9 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過(guò)后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在2~30 ℃為宜，不可凍存。