瓊脂糖-蛋白A蛋白G融合蛋白親和填料

1 、產(chǎn)品介紹

PAG NUPharose FF是將重組蛋白A蛋白G融合蛋白（r-PAG,Nuptec NRPA14）鍵合在瓊脂糖凝膠微球上形成的親和分離介質(zhì)。與單獨(dú)的蛋白A或蛋白G分離介質(zhì)相比，具有更寬廣的結(jié)合范圍，可以與人的所有IgG亞型、IgA、IgE、IgM結(jié)合，但不能與小鼠的IgA、IgM和血清白蛋白結(jié)合，適合用于鼠IgG單抗的提取和檢測(cè)。同時(shí)融合后的r-PAG降低對(duì)pH的依賴，允許在pH5-8進(jìn)行結(jié)合。

2 、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a 90%體積以上的微球在此粒徑范圍；b DBC10%測(cè)試條件為：10%流穿，6min停留時(shí)間；c 推薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下2~6min停留時(shí)間的使用條件，并非只能在該流速范圍內(nèi)工作；d 10cm柱高下的最大測(cè)試流速。

3 、PAG 對(duì)各類抗體的親和性

PAG NUPharoseFF對(duì)多種哺乳動(dòng)物抗體的親和性如下表所示，與單獨(dú)的蛋白A或蛋白G分離介質(zhì)相比，蛋白A蛋白G融合蛋白具有更寬廣的結(jié)合范圍。

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí)，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。PAGNUPharoseFF的壓縮比為1.15。為使達(dá)到裝柱比，可通過(guò)柱頭下壓的方法，也可以通過(guò)高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器）， 為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后， 用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵，打開(kāi)柱頭上的閥門(mén)/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門(mén)/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱因子（As）來(lái)評(píng)價(jià)。柱效測(cè)定可以采用丙酮或者NaCl作為樣品進(jìn)行，按照下表配制樣品溶液和流動(dòng)相。

根據(jù)UV或者電導(dǎo)率曲線計(jì)算理論塔板高度（HETP）、理論塔板數(shù)（N）和非對(duì)稱 因子（As），公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L為柱高；VR為保留體積；Wh為半高峰寬；a為在10%峰高處的第一個(gè)半峰寬；b為在10%峰高處的第二個(gè)半峰寬。

一般來(lái)說(shuō)，HETP的數(shù)值應(yīng)小于填料平均粒徑的三倍（即HETP/D50<3 ，D50為填料的平均粒徑），As應(yīng)在0.8~1.5之間。

4.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

PB緩沖液（20mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液A。

在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，該過(guò)程通常需要5~10個(gè)柱體積的緩沖液A，以電導(dǎo)、pH等檢測(cè)信號(hào)參數(shù)不變且與緩沖液A對(duì)應(yīng)為準(zhǔn)。

上樣量可按“mg目標(biāo)蛋白/mL填料"來(lái)設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%，例如PAG NUPharose FF產(chǎn)品對(duì)人IgG的DBC10%為~40mg/mL，上樣量可控制為20~32mg/mL。在條件篩選階段，也可以降低上樣品，觀察結(jié)合、特異性和洗脫情況。上樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行離心（10000 g以上）、過(guò)濾（0.22或0.45μm）處理，以免堵塞色譜柱。

上樣后需要3~10個(gè)柱體積的緩沖液A再平衡層析柱。

4.4 洗脫與再生（Elution & Regeneration）

最-常用的洗脫方式為pH=2.5~3.0的甘氨-酸、檸檬酸鹽或乙酸鹽，該條件可基本將抗體完-全洗脫。但該pH較低，可能會(huì)使一些抗體失活或聚集，在條件篩選階段可逐步降低pH，篩選出收率可接受、抗體不失活或不聚焦的最高pH。也可以將洗脫液收集在弱堿性的緩沖液中，中和至中性，以縮短低pH條件的接觸時(shí)間。洗脫之后，可用5~10個(gè)柱體積的洗脫液對(duì)色譜柱進(jìn)行再生。 

4.5 在位清洗（CIP）

多次使用后會(huì)有沉淀蛋白，強(qiáng)疏水性蛋白，脂蛋白，脂質(zhì)體等非特異吸附凝膠上，可以用0.1%去垢劑短時(shí)間清洗，如0.1% Triton X-100清洗2個(gè)柱體積，立即用結(jié)合緩沖液洗5-10個(gè)柱體積。也可以用70%乙醇清洗作同樣清洗。

4.6 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過(guò)后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在2~8℃為宜，不可凍存。